Rezultat etapa a VII -a

UTILIZAREA METODELOR NECESARE DETECTARII TULPINILOR IZOLATE IN CADRUL PROIECTULUI


În cadrul activităților acestei etape au fost utilizate metodele necesare detectării tulpinilor izolate în cadrul proiectului care au potențial de producere a hidrogenului molecular. Într-o primă fază au fost obținute culturile cianobacteriene axenice, din care s-a izolat ADN genomic utilizat la amplificarea prin PCR a genei codificatoare a hidrogenazei bidirecționale. Pentru verificarea apartenenței tulpinilor analizate la un anumit gen/specie este necesară amplificarea și secvențarea genei pentru ARNr 16S și a fragmentului intergenic ITS. În vederea verificării preliminare a potențialului tulpinilor de a produce hidrogen s-a impus verificarea prezenței și ulterior secvențarea geni hoxH implicată în sinteza hidrogenazei bidirecționale.

Amplificarea prin PCR a genei ADN16S-ITS a generat profilurile electroforetice aşteptate cu benzi de aproximativ 2000 de perechi de baze atât la Oscillatoriales cât şi la Chroococcales.

În ceea ce privește tulpinile gena hoxH, la o parte din cele 11 tulpini analizate s-au obținut produși de amplificare de 1200 – 1300 pb. Pe langă aceste benzi specifice, în unele cazuri au fost generate și unele nespecifice, motiv pentru care s-a luat decizia de a utiliza metoda Touch-Down PCR, pentru evitarea legării amorselor în locuri nespecifice.

În continuare s-a efectuat secvențarea genei pentru ARNr 16 și a ITS (Internal Transcribed Spacer) precum și a subunității mari a hidrogenazei bidirecționale la tulpini aparţinând ordinelor Nostocales și Chroococcales din cadrul Colecţiei de Cianobacterii şi Alge (AICB) a Institutului de Cercetări Biologice din Cluj-Napoca. În urma screening-ului cu amorse specifice pentru hidrogenaze am selectat pentru secvențare 10 tulpini cianobacteriene, 3 aparținând grupului nostocalelor și 7 grupului croococalelor. Amplificarea prin PCR a genei ADN16S-ITS a generat profilurile electroforetice aşteptate cu benzi de aproximativ 2000 de perechi de baze atât la Nostocales cât şi la Chroococcales.

În ceea ce privește gena hoxH ce codifică hidrogenaza bidirecțională, la tulpinile de Chroococcales și la tulpina AICB 421 s-au obținut secvențe nucleotidice de aproximativ 1300 pb, ceea ce este în concordanță cu dimensiunea benzilor observate pe gelul de agaroză. Compararea acestor secvențe cu bazele de date prin BLAST a confirmat faptul ca ele sunt într-adevăr  gene hoxH. În cazul tulpinilor AICB 709 și 743, au fost obținute secvențe mai scurte de 276 respectiv 736 de nucleotide. Compararea lor cu bazele de date a relevat că și acestea pot fi  hidrogenaze bidirecționale, dar gradul de similaritete cu alte hidrogenaze bidirecționale este mai scăzut.

Două tulpini cianobacteriene de interes, Synechococcus sp. PCC 7002 și Anabaena variabilis ATCC 29413 au fost analizate din punctul de vedere al expresiei genelor aparținând familiei psbA, în condiții de stres date de radiația luminoasă intensă, respectiv de radiația UVB.

Tulpina cianobacteriană Synechococcus sp PCC 7002 prezintă o sensibilitate diferită la stresul cu radiaţie luminoasă în exces în funcţie de genele PsbA luate în considerare. Acest rezultat certifică o dată în plus faptul că cele două tipuri de gene (codificatoare ale proteinei D1, respectiv a izoformei D1’) acţionează diferit în funcţie de factorii de mediu. Ambele gene sunt induse, deşi nu în aceeaşi măsură, în condiţiile luminii în exces, fapt care sprijină ipoteza că proteina D1’ are rol în suplinirea funcţiilor proteinei D1 în condiţii prelungite de stres. În tulpina Synechococcus sp PCC 7002 nivelul de exprimare al genei care codifică proteina D1’ creşte semnificativ după revenirea la condiţii normale, sugerând astfel faptul că această genă joacă un rol important nu doar în perioada expunerii culturii la lumina în exces, ci şi la reacomodarea la condiţii normale. Rolul mai important în reacomodarea celulelor de Synechococcus sp PCC 7002  la condiţii normale după expunerea culturii la lumină în exces pare să revină proteinei D1’.

La Anabaena variabilis ATCC 29413radiația UVB induce o creștere a nivelului de expresie al genei psbA4 de până la 4x în 60 min. Datorită faptului că proteina D1 codificată de psbA4 prezintă un înalt grad de similaritate a secvenței aminoacidice cuizoforma D1:1 codificată de gena psbAI de la Anabaena sp. PCC 7120, precum și reziduul aminoacidic Gln130, ne-am aștepta ca proteina codificată de psbA4 de la Anabaena sp. PCC 7120 să fie tot de tip D1:1 și să fie reprimată de expunerea la stresul UVB, așa cum a fost arătat în cazul genei ortoloage de la Anabaena sp. PCC 7120.