Rezultat etapa a III -a

OPTIMIZAREA METODELOR CE URMEAZA A FI UTILIZATE


I. Designul si testarea amorselor

(rezultate finale la activitatea 1.1.2)

Conform rezultatelor obtinute in cadrul acestei activitati, se poate considera ca obiectivele au fost indeplinite in totalitate. Prin metode specifice s-a obtinut o serie de amorse oligonucleotidice care au fost achizitionate si ulterior testate.

in urma amplificarii prin PCR a genei cianobacteriene hoxH, responsabila de sinteza hidrogenazei bidirectionale, s-au obtinut benzi electroforetice clare, in special la tulpinile cianobacteriene-model. Aceasta demonstraza fcaptul ca amorsele alese sunt adecvate, si pot fi utilizate ulterior in etapele bazate pe studiul genei hidrogenazice.

Dintr-un numar mare de amorse testate, au fost selectate 8 care s-au dovedit a fi specifice analizei genelor psbA si ppC la tulpina cianobacteriena Synechococcus sp. PCC 7002.

La tulpina Cyanothece sp. ATCC 51142, conform profilurilor de amplificare ale genelor psbA si ale genei de referinta pepC s-a stabilit o temperatura optima de aliniere de 57oC la toate genele analizate in vederea efectuarii analizelor ulterioare (RT-PCR).

Pentru experimentele ulterioare (RT-PCR) la tulpina Cyanothece sp. ATCC 51142 au fost selectate amorsele din prima serie pentru genele psbA3, psbA si pepC, iar pentru genele psbA2, psbA4 si psbA1 amorsele din a doua serie de testare.

II. Design-ul anticorpilor, achizitia si testarea lor

(rezultate finale la activitatea 1.1.3)

Rezultate si discutii

Anticorpii achizitionati au fost aplicati cu succes. Rezultatele imunoblotingului au reliefat prezenta izoformelor proteinei D1 (?36-39 kDa) la toate cianobacterii investigate pana in momentul de fata, atat in cazul probelor prelevate din biomasa barbotata cu aer atmosferic, cat si in cazul celor la care s-a administrat argon (fig. 1, fig. 2, fig. 3). Rezultatele au fost detaliate in cadrul activitatii 1.3.2. Avand in vedere faptul ca toate izoformele proteinei D1 au aproximativ aceeasi greutate moleculara (39 kDa) este imposibil de precizat care izoforma a fost evidentiata prin imunoblot pe membrana nitrocelulozica. Acest fapt limiteaza concluziile care se pot trage la ‘pool-ul’ de proteina D1, fara a putea diferentia intre contributiile individuale ale membrilor familiei de gene psbA la fondul celular de proteina D1. Oricum, ne da posibilitatea de a urmari modificarile pe care le sufera cantitatea totala de proteina din celula, cand aceasta este expusa la diferiti factori de stres.

III. Achizitia si initierea culturilor de cianobacterii model folosite

(rezultate finale la activitatea 1.1.4)

Cele 5 tulpini cianobacteriene model a caror procurare a fost descrisa in RP1 si RP2 au fost initiate si mentinute in cultura in Colectia de Alge si Cianobacterii a Institutului de Cercetari Biologice, Cluj-Napoca pentru a servi ca tulpini de referinta. Tulpinile cianobacteriene de referinta achizitionate din colectiile internationale de culturi, pe baza criteriilor deja mentionate, reprezinta cele mai studiate si mai bine cunoscute cianobacterii. Ele au fost bine studiate atat din punct de vedere al fiziologiei cresterii si nutritiei cat si la nivelul exprimarii genelor in diferite conditii ale factorilor de mediu. in tabelul nr.1 sunt prezentate cateva informatii referitoare la genomurile acestor tulpini. in concluzie, au fost procurate din colectiile internationale de culturi 5 tulpini cianobacteriene de referinta, cu genomul complet secventat. Tulpinile au fost depozitate in colectia proprie de cianobacterii si alge a institutului (AICB), cu pastrarea codurilor originale, pe mediile nutritive specificate de furnizor sau de studiile publicate in literatura.

IV. Optimizarea protocoalelor de izolare ADN si ARN

(rezultate finale la activitatea 1.1.5)

Rezultatele bune obtinute cu aceste kit-uri se datoreaza probabil unei lize eficiente a celulelor: enzimatica in cazul GeneJET Genomic DNA Purification Kit si enzimatica combinata cu o liza mecanica prin vortexare cu bilute de sticla la ZR Fungal/Bacterial DNA Kit. Deasemenea, fixarea ADN-ului se face pe coloane cu filtre pentru extractie ceea ce impiedica pierderile de ADN care pot avea loc in timpul manipularii la kit-urile care nu sunt prevazute cu colonite pentru extractie. La aceste kit-uri selectate pentru izolarea de ADN s-au facut modificari in ceea ce priveste timpii de centrifugare, incubare dar si cantitatea de solutie de eluare a ADN-ului de pe membrana colonitelor, astfel imbunatatindu-se randamentul de izolare.

Faptul ca nu s-a putut extrage ADN cu celelalte doua kit-uri, Wizard® Genomic DNA Purification Kit de la Promega™ si Wizard® SV Genomic DNA Purification System de la Promega&trade, se datoreaza probabil incapacitatii solutiilor de liza din acste kit-uri de a distruge peretii celulari ai cianobacteriilor, care la numeroase tulpini sunt foarte rezistenti. Prezenta mucilagiilor asociate cu unele tulpini creste si mai mult dificultatea lizei celulare si impiedica extragerea eficienta de ADN genomic.

Astfel cele doua kit-uri vor putea fi folosite cu succes pentru izolarea materialului genetic de la tulpinile cianobacteriene model pentru studiul expresiei genelor psbA care codifica proteina D1 din componenta fotosistemului II, si de asemenea pentru alte cianobacterii din colectia AICB a Institutului de Cercetari Biologice din Cluj-Napoca.

Din rezultatele prezentate in tabelul de mai sus s-a constatat faptul ca vortexarea cu bile inainte de incubare, la viteza maxima timp de aproximativ 3-5 minute are un efect major asupra cantitatii de ARN izolata.

In urma migrarii pe gel de agaroza s-a constatat ca vortexarea cu beat beeter-ul nu afecteaza integritatea ARN-ului extras.

I. STUDIUL EFECTULUI GAZELOR ATMOSFERICE sI A ARGONULUI ASUPRA STRUCTURII sI FUNCtIEI FOTOSISTEMULUI II LA TULPINILE CIANOBACTERIENE DIN GRUPUL NOSTOCALELOR

(Rezultat pentru activitatea 1.3.1.1.2.)

Rezultatele obtinute privind efectele gazelor atmosferice cu inducerea anaerobiozei asupra activitatii fotosistemului PS II se raporteaza dinamicii fluorescentei clorofilei si a componentilor fotosintetici specifice fiecarei tulpini de cianobacterie din grupul nostocalelor.

Componentii aparatului fotosintetic la nostocalele Aphanizomenon elenkinii AICB 717, Anabaenopsis sp. AICB 709, Cylindrospermum alatosporum AICB 421 si Nostoc linckia AICB 39 precum clorofila a, carotenoidele si ficobiliproteinele identificate pe baza spectrului de absorbtie nu au suferit modificari semnificative in conditii de anaerobioza, comparativ cu martorul.

Activitatea fotosistemului PS II monitorizata prin productia de fluorescenta minima (Fo) si fluorescenta maxima (Fm) s-a redus in primele 60 min de anaerobioza urmand o usoara crestere la finalul tratamentului cu argon. Exceptie a facut tulpina Anabaenopsis sp. AICB 709 la care s-au inregistrat valori relativ egale intre F0 si Fm din cauza nedeschiderii in totalitate a centrilor de reactie PS II. Starea redox de oxidare/reducere a centrilor de reactie PS II a scazut in intensitate in primele momente de anaerobioza.

Productia cuantica maxima a PS II (F/Fm) si productia cuantica efectiva (Y(II)) au inregistrat o variabilitate crescuta raporta speciei utilizate. in general, productia cuantica a centrilor de reactie a crescut in conditii de anaerobioza la inceput, iar la finele tratamentului cu argon a scazut. Productia cuantica a disiparii neregulate a energiei (Y(NO)), s-a manifestat intens pe durata tratamentului. Coeficientul fotochimic qP (masura estimata a centrilor de reactie deschis ) si coeficientul quenching fotochimic qL, care este masura reala a centrilor de reactie deschisi, au avut o crestere asemanatoare iar valoric s-au apropiat de unu exemplificand starea redox oxidativa a centrilor de reactie PS II. Quenchingul fotochimic si productia cuantica a disiparii neregulate sunt maxime, ceea ce denota ca exista o slaba conversie fotochimica a energiei, iar cauzele vin de la nivelul complexului antenar de captarea luminii care este sarac in ficobilisomi. Oscilatiile starilor de oxido/reducere sunt bine evidentiate prin cinetica inductiei fluorescentei si a curbei de fluorescenta.

In prezenta inhibitorului DCMU (3-(3,4-diclorofenil)- 1,1-dimetilurea), care inhiba transferul electronilor de la centrii de reactie PS II la plastochinona, s-a inregistrat o slaba stare de energizare ducand la valori relativ egale intre Fo si Fm din cauza ca toti centrii de reactie PS II devin inchisi (redusi) ducand la scaderea fluorescentei variabile (Fv). Eficienta fotochimica a fotosistemului PS II si productia cuantica efectiva s-au redus, iar productia cuantica a disiparii neregulate a energiei Y(NO) a crescut odata cu coeficientii de quenching fotochimici. Efectul DCMU explica heterogenitatea antenei fotosistemului PS II: exista restrictii de consumare a energiei la nivelul PS II privind transferul excitatiei. DCMU ajuta la inchiderea totala a centrilor de reactie.

II. Cuantificarea unor proteine cheie din lantul transportor de electroni in conditiile modificarii compozitiei gazelor din mediu la tulpini cianobacteriene din grupul nostocalelor

(rezultate finale la activitatea 1.3.2.1.2)

Screening-ul pentu evidentiarea izoformelor proteinei D1, implicate in structura si functia fotosistemului II la cianobacterii din ordinul Nostocales (colectia AICB) a inclus 4 tulpini din genuri diferite dupa cum urmeaza: Cylindrospermum alatosporum Fritsch AICB 39, Nostoc linckia (Roth) Bornet et Flahault AICB 421, Aphanizomenon elenkinii Kiselev AICB 709, Anabaenopsis sp. AICB 717.

Pattern-ul electroforetic al extractelor proteice obtinute din biomasa celor patru cianobacterii studiate, nu a reliefat diferente intraspecifice. Astfel, nivelul de traducere al proteinelor ramane nemodificat in conditii de barbotare cu argon, fata de conditiile de referinta induse prin administrare de aer atmosferic. Diferentele de pattern obtinute in unele cazuri (Nostoc linckia (Roth) Bornet et Flahault AICB 421) sunt cel mai probabil datorate unor erori de tehnica.

Izoformele proteinei D1 (aproximativ 36kDa) au fost prezente in toate extractele proteice, la toate tulpinile cianobacteriene din ordinul Nostocales, indiferent de gazul care a fost administrat (aer sau argon) sau de durata barbotarii. Pozitia si intensitatea benzilor electroforetice a fost similara atat inter- cat si intraspecific. Concentratiile mai scazuta ale proteinei D1 din unele probe (Nostoc linckia (Roth) Bornet et Flahault AICB 421, Anabaenopsis sp. AICB 717) sunt cel mai probabil datorate unor erori de tehnica. Oricum acest fapt ramane sa fie elucidat in experimente ulterioare.

Greutatea moleculara aprope identica, dar si similaritatea ridicata la nivelul secventei primare ale izoformelor proteinei D1 face imposibila evidentierea individuala a acestora prin imunoblot (Western blott). Dezvoltarea unor mijloace de detectie sensibile la modificari mici in secventa primara a catenelor polipeptidice ar putea oferi in viitor un raspuns la aceasta problema.

III. Efectuarea unui screening initial pentru identificarea tulpinilor din grupul nostocalelor care contin hidrogenaze

(rezultate finale la activitatea 1.4.1.1)

In urma analizei morfologice a 35 de tulpini cianobacteriene apartinand ordinului Nostocales, au fost selectate 23 de tulpini spre a fi verificate pentru prezenta genei hoxH.

8 din cele 23 de tulpini au generat benzi electroforetice de dimensiunea celei asteptate, teoretic indicand ca aceste tulpini contin gena hoxH.

Cele 8 tulpini selectate au generat benzi electroforetice clare in urma amplificarii cu amorsele special concepute pentru qPCR, certificand posibilitatea utilizarii acestora in studiul expresiei genei hoxH.

Studiul efectului atmosferei modificate asupra producerii de hidrogen

(rezultate partiale la activitatea 1.5.1.1)

in faza incipienta a acestei activitati a fost consultata literatura de specialitate referitoare la influenta diferitelor conditii de crestere asupra producerii de hidrogen.

Rezultate si discutii

Conversia din mV in concentratie de O2 se face pe baza formulei:
      C= a x (S-S0)/(Sat-S0),     (1)
unde:
S - valoarea citita la un moment dat;
S0 - limita inferioara (valoarea 0);
Sat - limita superioara (de saturatie);
a - coeficientul de solubilitate a O2 in solutia in care se face citirea, depinzand de salinitatea solutiei si de temperatura. Conversia din mV in concentratie de H2 se face pe baza aceleiasi formule (1).

Cuantificarea hidrogenazelor de interes sub actiunea modificarii gazelor atmosferice

(rezultate partiale la activitatea 1.5.2.1)

Cele 8 tulpini selectate au generat benzi electroforetice clare in urma amplificarii cu amorsele special concepute pentru qPCR, certificand posibilitatea utilizarii acestora in studiul expresiei genei hoxH.

Concentratia produsilor de amplificare ai genelor hoxH la tulpinile selectate s-a incadrat in domeniul 128 - 346 ng/µl. Astfel, s-a confirmat faptul ca aceste tulpini pot fi folosite eficient in studiile ulterioare bazate pe analiza hidrogenazei bidirectionale.

Tratamentul cu argon a influentat cantitatea de ampliconi hoxH rezultati, aceasta crescand odata cu scaderea concentratiei oxigenului dizolvat.

Identificarea unor medii specifice cu potential deosebit in descoperirea unor hidrogenaze noi si productie de hidrogen semnificativa si efectuarea unor expeditii exploratorii in teren

(rezultate partiale la activitatea 1.6.1)

In faza incipienta a acestei activitati a fost consultata literatura de specialitate In vederea identificarii unor medii specifice si/sau specii cianobacteriene de interes pentru testarea producerii de hidrogen si a fost efectuata o deplasare In teren.

In Campia de Vest a Romaniei, Intre anii 1970-1980, au fost efectuate o serie de foraje In vederea identificarii unor zacaminte de petrol. Marea majoritate a acestor foraje au dus doar la descoperirea unor izvoare geotermale, care au fost captate si utilizate apoi In diverse scopuri. O parte, Insa, din izvoarele geotermale au ramas neutilizate, astfel ca, In timp, s-au dezvoltate comunitati microbiene termofile, dominate de cianobacterii.

In cadrul deplasarii pe teren au fost vizitate forajele de la Ciocaia, Sacuieni si Marghita (jud. Bihor) pentru o prima caracterizare a biotopurilor si pentru colectarea de probe din comunitatile cianobacteriene, unde a fost cazul. Materialul viu a fost investigat prin microscopie optica si de fluorescenta folosind un microscop Nikon eclipse TE2000-U (fig. 1 e-f). Astfel, au fost observate doar cianobacterii filamentoase, fara heterocisti, cel mai probabil apartinand ordinului Oscillatoriales, genul Phormidium. Unele cianobacterii apartinand acestui gen sunt cunoscute ca bune producatoare de biohidrogen, astfel ca In cele ce urmeaza se va Incerca izolarea taxonilor cianobacterieni din comunitatea de la Ciocaia In culturi pure. Aceste culturi pure vor fi folosite ulterior pentru testarea si optimizarea procesului de producere de hidrogen.

Studiul efectului gazelor atmosferice si a argonului asupra expresiei genelor implicate in fotosinteza la tulpini de cianobacterii de interes

(rezultate partiale la activitatea 1.7.1)

La Anabaena variabilis ATCC 29413, instalarea conditiilor de microarobioza prin barbotare cu argon a determinat inductia genelor psbA5 si psbA6, care codifica proteine de tip D1'.

La Anabaena variabilis ATCC 29413, toate genele psbA studiate din cadrul acestei familii, cu exceptia psbA4 (expresie constanta) si psbA5 (scadere a expresiei) prezinta o crestere accentuata a nivelului de expresie in decursul celei de-a doua ore de barbotare cu argon. Acest fapt sugereaza nevoia crescuta de proteina D1 a celulei in conditii de stres microaerobiotic, de unde necesitatea cresterii nivelului de transcriptie a genelor psbA si implicit, a cantitatii de proteina codificata.

La Anabaena variabilis ATCC 29413, nivelul de transcript al genei psbA4 este constant in conditiile investigate si relativ abundent, comparabil cu cel al rnpB.

La Anabaena variabilis ATCC 29413, gena de referinta rnpB nu isi modifica semnificativ nivelul de expresie in conditiile investigate, fiind potrivita pentru studiul conditiilor de microaerobioza.

La Cyanothece sp. ATCC 51142, in conditii normale de crestere, expresia genelor psbA1, psbA3 si psbA5, codificatoare ale izoformelor proteinei D1 este mai ridicata fata de cea a genei de referinta (pepC). Nivelul de ARNm pentru genele psbA2 si psbA4, codificatoare ale formei D1'(forma de rezistenta la stres) este mai mic fata de cel al genei de referinta (pepC).

La Cyanothece sp. ATCC 51142, inducerea microarobiozei prin barbotare cu argon a determinat, cresterea nivelului de transcriere ar tuturor genelor psbA analizate. Cel mai mare nivel de exprimare s-a realizat in cazul genei psbA2, codificatoare a proteinei D1', care manifesta o rezistenta mai mare in conditii de stres.

La Cyanothece sp. ATCC 51142, mentinerea conditiilor de stres a determinat o sinteza accentuata a produsilor de transcriere pentru toate genele psbA (in special pentru cele codificatoare ale formei D1') chiar si dupa doua ore de la inducerea microaerobiozei. Raspunsul adaptativ al celulelor cianobacteriene la conditiile de stres s-a realizat in aproximativ o ora de la inceperea administrarii argonului.