Rezultat etapa a II -a

I.STUDIUL EFECTULUI GAZELOR ATMOSFERICE SI A ARGONULUI ASUPRA STRUCTURII SI FUNCTIEI FOTOSISTEMULUI II LA TULPINILE CIANOBACTERIENE MODEL
(Rezultat pentru activitatea 1.3.1.1.1.)


Rezultatele obtinute au evidentiat o activitate fotochimica a fotosistemului PS II specifica fiecarei tulpini cianobacteriene, fiind influentata direct de gazul atmosferic sau tehnic utilizat, efecte care s-au evidentiat in dinamica fluorescentei clorofilei si a componentilor fotosintetici.

Componentii aparatului fotosintetic la cianobacterii sunt clorofila a, carotenoidele si ficobiliproteinele formand unitatea captatoare de lumina. Ficobiliproteinele identificate au fost ficocianina si aloficociania. Spectrul de absorbtie in vivo al suspensiei celulare evidentiaza zonele spectrale de absorbtie al constituentilor aparatului fotosintetic. Comparativ cu controlul, concentratia in clorofila, xantofile si ficobiliproteine a crescut in anaerobioza indusa prin argon la Anabaena. La Cyanothece biomasa celulara si ficobiliproteinele acumulate au fost reduse cantitativ.

Fotochimia fotosistemului PS II prezinta o fluorescenta minima (Fo) crescuta care scade la finalul tratamentului cu argon deoarece creste plastochinona in stare redusa. Fluorescenta maxima (Fm) creste sub conditiile anaerobe cand acceptorul primar de electroni din PS II este in intregime redus. O evolutie asemanatoare are si fluorescenta variabila (Fv). La Cyanothece, fluorescenta minima si maxima s-au egalizat valoric determinand scaderea semnificativa a fluorescentei variabile. Valorile ridicate ale lui Fo atesta proportia mare de centrii de reactie inchisi si deconectarea unor complexe de la captarea luminii la nivelul fotosistemului PS II.

Eficienta fotosistemului PS II (Fv/Fm) si productia cuantica efectiva (Y(II)) scad la finalul conditiilor anaerobe la Anabaena. Productia cuantica a disiparii energiei neregulat (Y(NO)), capata valori mai mari si are tendinta de crestere la final. Coeficientul fotochimic qP (masura estimata a centrilor de reactie deschis ) creste, iar in conditii de anaerobioza se reduce progresiv. Coeficientul quenching fotochimic qL, care este masura reala a centrilor de reactie deschisi, are o evolutie asemanatoare. Valoarea ridicata a lui qL exprima utilizarea energiei de excitare in fotochimie in centrii de reactie, iar fluorescenta este redusa. La Cyanothece, eficienta maxima a fotosistemului PS II a crescut. Productia cuantica efectiva Y(II) a crescut sub efectul argonului. Productia cuantica a disiparii regulate a energiei (Y(NPQ)) a fost nula, iar productia cuantica a disiparii neregulate a energiei Y(NO) a capatat valori maxime cu tendinta de scadere la finalul tratamentului cu argon. Coeficientul de quenching qL a atins valori maxime ceea ce arata proportia mare a centrilor de reactie PS II deschisi. Quenchingul fotochimic si productia cuantica a disiparii neregulate sunt maxime, ceea ce denota ca exista o slaba conversie fotochimica a energiei, iar cauzele vin de la nivelul complexului antenar de captarea luminii care este sarac in ficobilisomi.

Presiunea de excitatie (1- qL) scade in conditii de anaerobioza ca spre final sa creasca semnificativ, dar valoric raman sub valorile martorului la Anabaena. Cresterea presiunii de excitare arata dezechilibrul energetic intre fotochimie, transferul de electroni si metabolism ducand la reducerea marimii antenei PS II si a reducerii eficientei fotosintetice evidentiata in productia cuantica.

Pe baza curbei de inductie la Cyanothece constatam ca oxidarea marginii acceptoare este diminuata, iar dupa alte pulsuri de lumina, reoxidarea atinge valori superioare. Sub tratamentul cu argon, curba de inductie a aratat o usoara refacere a productiei de fluorescenta.

In prezenta inhibitorului DCMU (3-(3,4-diclorofenil)- 1,1-dimetilurea) care inhiba transferul electronilor de la centrii de reactie PS II la plastochinona, s-a inregistrat o slaba stare de energizare ducand la valori relativ egale intre Fo si Fm din cauza ca toti centrii de reactie PS II devin inchisi (redusi) ducand la scaderea fluorescentei variabile (Fv). Eficienta fotochimica a fotosistemului PS II si productia cuantica efectiva se reduc semnificativ, iar productia cuantica a disiparii energiei neregulate Y(NO) creste odata cu coeficientul de quenching fotochimic qL. Efectul DCMU explica heterogenitatea antenei fotosistemului PS II: exista restrictii de consumare a energiei la nivelul PS II privind transferul excitatiei. DCMU ajuta la inchiderea totala a centrilor de reactie.

Curba de inductie a fluorescentei la suspensiile celulare martor in prezenta decuplantului DCMU a aratat o lipsa de energizare la nivelul centrilor de reactie PS II cu o emisie de fluorescenta minima. In prezenta de argon si DCMU, activitatea fotochimica a fotosistemului PS II a ramas inhibata.

Cianobacteria Synechocystis a fost crescuta sub amestecul de gaze 95% aer sintetic (20% O2 + 80% N2) si 5% CO2 in timpul fazei de crestere exponentiala urmata de reducerea cantitatii de CO2 la 0,03% timp de 2 ore. Cantitatea de biomasa reala a fost mai redusa, spectrul in vivo a evidentiat prezenta clorofilei a, carotenoidelor si a ficobilinelor. Prin reducerea CO2 componentii pigmentari au crescut valoric, comparativ cu martorul.

Fluorescenta minima a clorofilei la martor a crescut sub amestecul de aer sintetic (20% O2 + 80% N2) imbogatit cu 5% CO2 deoarece centrii de reactie PS II nu sunt deschisi in totalitate, determinand obtinerea de valori destul de ridicate. Sub CO2 redus la 0,3%, fluorescenta minima tinde sa scada odata cu timpul expunerii. Fluorescenta maxima (Fm) a crescut semnificativ, iar in prezenta CO2 redus a manifestat tendinta de scadere. Fluorescenta variabila si eficienta maxima a PS II (Fv/Fm ) s-au redus in prezenta concentratiei reduse de CO2.

Productia cuantica efectiva a PSII (Y(II)) s-a redus sub tratamentul cu CO2 diminuat datorita diminuarii fluorescentei. Valorile lui Y(II) sunt aproximativ egale cu valorile productiei fotochimice maxime (Fv/Fm) ceea ce denota o stare de energizare scazuta la nivelul tilacoidelor. Productia cuantica a disiparii regulate a energiei Y(NPQ) a inregistrat valori nule, probabil din cauza luminii de intensitate medie care nu aduce energie de excitare in exces. Productia cuantica a disiparii neregulat a energiei Y(NO) a crescut ceea ce atesta eficienta mai redusa a conversiei fotochimice a energiei de excitatie.

Coeficientul de quenching fotochimic qL care este masura centrilor de reactie PS II deschisi a crescut sub tratamentul cu CO2 diminuat. Coeficientul fotochimic qP care este masura unitatilor PS II capabile de reducerea plastochinonei, a continuat sa creasca sub tratamentul cu CO2. Exista o paralela intre evolutia coeficientilor de quenching fotochimic si productia cuantica a transportului neciclic de electroni.

Presiunea de excitare (1-qL) care este masura proportiei de QA in stare redusa, a inregistrat o scadere semnificativa sub tratamentul cu CO2 diminuat comparativ cu valorile martorului. Reducerea presiunii de excitare prin tinerea unei proportii mari de QA in stare oxidata evidentiaza diminuarea activitatii transportului liniar de electroni.

In prezenta decuplantului DCMU (3-(3,4-diclorofenil)-1,1-dimetilurea), fluorescenta minima si maxima au inregistrat valori relativ ridicate si apropiate cu o usoara tendinta de crestere spre finalul tratamentului cu CO2 diminuat ceea ce atesta starea inchisa a centrilor de reactie PS II. Fluorescenta variabila si eficienta maxima a fotosistemului PS II scad la minim ceea ce explica starea de inactivare a centrilor de reactie a fotosistemului PS II.

In experientele noastre, simultan am masurat si fluorescenta clorofilei fotosistemului PS I. Cand fotosistemul PS II este inhibat, curentul ciclic de electroni opereaza la o rata maxima inducand sinteza de ATP necesar in ciclul Calvin. La cianobacterii si algele unicelulare, curentul ciclic opereaza in conditii de anaerobioza. P700 este clorofila centrului de reactie PS I. El este oxidat dupa iluminare, transferand electronii la feredoxina si contribuind la reducerea NADP si la fixarea CO2. El este re-redus prin lantul transportor de electroni intersistemic. Initial centrul de reactie P700 este in stare redusa, se oxideaza prin lumina rosie de lungime de unda mare, apoi scade semnalul din cauza re-reducerii intrasistemice cu electroni de la fotosistemul PS II.

II. CUANTIFICAREA UNOR PROTEINE CHEIE DIN LANTUL TRANSPORTOR DE ELECTRONI IN CONDITIILE MODIFICARII COMPOZITIEI GAZELOR DIN MEDIU LA CIANOBACTERIILE MODEL
(Rezultat pentru activitatea 1.3.2.2.1.)

Pattern-ul electroforetic al extractelor proteice obtinute din biomasa celor doua cianobacterii model studiate (Anabaena variabilis ATCC 29413 si Cyanothece sp. ATCC 51142), nu a reliefat diferente semnificative intre cele 6 probe analizate la fiecare tulpina. Astfel, nivelul de exprimare si traducere al proteinelor ramane nemodificat in conditii de barbotare cu argon, fata de conditiile de referinta induse prin administrare de aer atmosferic. Concentratia mai ridicata a extractului proteic obtinut la Cyanothece sp. ATCC 51142 in conditii de barbotare cu aer este cel mai probabil datorata unei erori de tehnica.

Izoformele proteinei D1 (aproximativ 39kDa) au fost prezente in toate extractele proteice, la ambele tulpini cianobacteriene model, indiferent de gazul care a fost administrat (aer sau argon) sau de durata barbotarii acestuia (in cazul argonului). Pozitia si intensitatea benzilor electroforetice au fost similare atat la probele prelevate de la aceeasi tulpina, cat si prin comparatie intre cele doua tulpini studiate. Concentratia mai scazuta a proteinei D1 din proba 2 la A. variablis ATCC 92413 este cel mai probabil datorata unei erori de standardizare a extractelor proteice. Oricum acest fapt ramane sa fie elucidat in experimente ulterioare.

Greutatea moleculara aprope identica, dar si similaritatea ridicata la nivelul secventei primare ale izoformelor proteinei D1 face imposibila evidentierea individuala a acestora prin imunoblot (Western blott). Dezvoltarea unor mijloace de detectie sensibile la modificari mici in secventa primara a catenelor polipeptidice ar putea oferi in viitor un raspuns la aceasta problema.

Design-ul si testarea amorselor
(rezultat partial activitatea 1.1.2.)

In prima etapa au fost identificate 7 tulpini de cianobacterii cu gene psbA care codifica posibile proteine D1' (a se vedea tabel 1, raport de progres nr. 1). In continuare, din cele 7 au fost selectate 4 tulpini cianobacteriene pentru construirea amorselor folosite in amplificarea partiala a genelor psbA si testarea lor virtuala:
-- Cyanothece sp. ATCC 51142
-- Synechococcus sp. PCC 7002
-- Arthropsira platensis NIES39
-- Anabaena variabilis ATCC 29419

DESIGN-UL ANTICORPILOR, ACHIZITIA SI TESTAREA LOR

(rezultat partial activitatea 1.1.3)

Rezultate si discutii

Izolarea proteinelor totale din cultura de Synechocystis sp. PCC 6803 a decurs normal, acestea fiind vizualizate cu ajutorului unui gel separat, colorat cu Coomassie Blue. Transferul proteinelor pe membrana nitrocelulozica a fost de asemenea apreciat ca fiind reusit, judecand dupa urmele de culoare generate de catre colorantul existent in markerul de greutate moleculara folosit. In final, dupa tratarea membranei cu cei doi anticorpi, si in urma analizei prezentei acestora prin developarea cu ajutorul tabletelor speciale, au putut fi observate cu claritate doua benzi de culoare inchisa. Conform markerului folosit, cele doua benzi indica prezenta a doua izoforme ale proteinei D1, teoretic cu greutate moleculara de aproximativ 25 si 34 kDa. Intre aceste doua benzi a existat o diferenta de intensitate, fiind imposibil de spus daca din cauza unei diferente de concentratie intre cele doua, sau ca urmare a unei erori in utilizare a tehnicii. In final, acest test a demonstrat faptul ca anticorpii au fost corect selectionati, acestia fiind potriviti pentru unul dintre scopurile proiectului nostru, si anume acela de a verifica prezenta, si intr-o oarecare masura si cantitatea proteinelor D1 cianobacteriene.

Optimizarea protocoalelor de izolare ADN si ARN

(rezultat partial activitatea 1.1.5.)

Izolarea ADN

Au fost testate un numar de patru kit-uri comerciale:
(i) Wizard® Genomic DNA Purification Kit, (Promega™);
(ii) Wizard® SV Genomic DNA Purification System, (Promega™);
(iii) GeneJET Genomic DNA Purification Kit (Fermentas™);
(iv) ZR Fungal/Bacterial DNA Kit (Zymo Research™).

Rezultatele cele mai bune din punctul de vedere al cantitatii dar si calitatii (puritate) ADN-ului genomic s-au obtinut cu kit-urile de la Fermentas (GeneJET Genomic DNA Purification Kit) si Zymo Research (ZR Fungal/Bacterial DNA Kit). Testarea acestor kit-uri s-a facut pe diferite tulpini de cianobacterii din colectia AICB a Institutului de Cercetari Biologice din Cluj-Napoca, dar si pe tulpinile cianobacteriene model.

Astfel cele doua kit-uri vor putea fi folosite cu succes pentru izolarea materialului genetic de la tulpinile cianobacteriene model pentru studiul expresiei genelor psbA care codifica proteina D1 din componenta fotosistemului II, si de asemenea pentru alte cianobacterii din colectia AICB a Institutului de Cercetari Biologice din Cluj-Napoca.